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高壓制備液相色譜分離純化的放大研究
2014-08-14查看:
利用高壓制備液相色譜裝備對千層塔中的石杉堿甲進行了分離提純放大研究，考察了填料大小、柱尺寸大小與上樣...
近年來，從自然資源中提取具有生物活性化合物的研究日益引起了人們的廣泛關(guān)注。源于植物中的抗腫瘤藥物紫杉醇及抗瘧活性成分青蒿素的發(fā)現(xiàn)促使人們特別是工業(yè)界人士開展更廣泛的研究。研究人員竭力研究高效的分離篩選方法，試圖從植物、海洋生物及微生物等自然資源中發(fā)現(xiàn)新的有效化合物，同時也需要一個快速、有效的分離方法以分離目標化合物。因此，學術(shù)界及工業(yè)界都需要有效的制備分離技術(shù)及其應用經(jīng)驗。
高壓制備液相色譜是一種使用高壓、大流量輸送系統(tǒng)在高分辨率、大內(nèi)徑、高載量分離柱上進行樣品高純度分離的液相色譜制備方法。應用該方法分離的產(chǎn)品在純度、回收率、分離效率等方面遠遠優(yōu)于傳統(tǒng)的制備方法，因此在生物制品、藥物研究和生產(chǎn)領(lǐng)域都得到了廣泛應用。
在對高壓制備液相色譜分離純化過程進行優(yōu)化時，影響分離純化效果的因素有很多，包括填料尺寸大小、色譜柱的柱徑、柱長、上樣量以及流動相的組成、流速等。將分析系統(tǒng)放大到制備型液相色譜意味著需要使用更大的制備柱、更高的流速和根據(jù)色譜柱的長度增加進樣量，在分析型液相色譜中，研究者已廣泛研究過填料尺寸、柱尺寸大小以及上樣方式等對分離效率的影響，但對制備型液相色譜分離純化過程進行優(yōu)化的研究卻鮮有報道。
本文利用自行生產(chǎn)的高壓制備液相色譜裝備，對千層塔中的石杉堿甲的制備分離過程進行了實驗研究，著重考察了填料大小、柱尺寸大小以及上樣方式對柱效和分離度的影響。
1 實驗部分
1.1 儀器和試劑
DASIO C18填料（dp=10、20、30、40 μm，蘇州麥可旺志生物技術(shù)有限公司）；高壓制備液相色譜柱（ID 50 mm×650 mm、ID 50 mm×1 000 mm、ID 150 mm×650 mm）；動態(tài)軸向加壓液壓站（聊城萬合工業(yè)制造有限公司）；制備高壓輸液泵：GLP3250；紫外-可見檢測器：UC-3292；Rheodyne3725i六通進樣閥；色譜工作軟件及電腦。此外，還有高效液相色譜儀、高速離心機、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。
氯仿、甲醇、氨水、硫酸、氫氧化鈉、純水均為分析純，石杉堿甲對照品（99.1%含量）。千層塔來源于重慶，經(jīng)鑒定符合中華人們共和國藥典（2010版）規(guī)定，均為分析純試劑，使用前先經(jīng)過整流處理再用孔徑為0.45 μm的微孔濾膜過濾。
1.2 工藝流程及方法
本文所建立的高壓制備液相色譜裝備分離工藝流程如圖1所示。樣品被注入色譜柱后，通過高壓制備輸液泵的壓力使洗脫液帶動樣品在固定相中移動，樣品組分依據(jù)兩相間作用能力的差別達到分離的目的，分離后的各組分經(jīng)檢測器檢測，再經(jīng)過工作站軟件和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)的運算處理以圖譜的形式呈現(xiàn)，最后通過餾分收集器分通道收集。
圖1 高壓制備液相色譜裝備分離工藝流程圖
高壓制備液相色譜是一種使用高壓、大流量輸送系統(tǒng)在高分辨率、大內(nèi)徑、高載量分離柱上進行樣品高純度分離的液相色譜制備方法。應用該方法分離的產(chǎn)品在純度、回收率、分離效率等方面遠遠優(yōu)于傳統(tǒng)的制備方法，因此在生物制品、藥物研究和生產(chǎn)領(lǐng)域都得到了廣泛應用。
在對高壓制備液相色譜分離純化過程進行優(yōu)化時，影響分離純化效果的因素有很多，包括填料尺寸大小、色譜柱的柱徑、柱長、上樣量以及流動相的組成、流速等。將分析系統(tǒng)放大到制備型液相色譜意味著需要使用更大的制備柱、更高的流速和根據(jù)色譜柱的長度增加進樣量，在分析型液相色譜中，研究者已廣泛研究過填料尺寸、柱尺寸大小以及上樣方式等對分離效率的影響，但對制備型液相色譜分離純化過程進行優(yōu)化的研究卻鮮有報道。
本文利用自行生產(chǎn)的高壓制備液相色譜裝備，對千層塔中的石杉堿甲的制備分離過程進行了實驗研究，著重考察了填料大小、柱尺寸大小以及上樣方式對柱效和分離度的影響。
1 實驗部分
1.1 儀器和試劑
DASIO C18填料（dp=10、20、30、40 μm，蘇州麥可旺志生物技術(shù)有限公司）；高壓制備液相色譜柱（ID 50 mm×650 mm、ID 50 mm×1 000 mm、ID 150 mm×650 mm）；動態(tài)軸向加壓液壓站（聊城萬合工業(yè)制造有限公司）；制備高壓輸液泵：GLP3250；紫外-可見檢測器：UC-3292；Rheodyne3725i六通進樣閥；色譜工作軟件及電腦。此外，還有高效液相色譜儀、高速離心機、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。
氯仿、甲醇、氨水、硫酸、氫氧化鈉、純水均為分析純，石杉堿甲對照品（99.1%含量）。千層塔來源于重慶，經(jīng)鑒定符合中華人們共和國藥典（2010版）規(guī)定，均為分析純試劑，使用前先經(jīng)過整流處理再用孔徑為0.45 μm的微孔濾膜過濾。
1.2 工藝流程及方法
本文所建立的高壓制備液相色譜裝備分離工藝流程如圖1所示。樣品被注入色譜柱后，通過高壓制備輸液泵的壓力使洗脫液帶動樣品在固定相中移動，樣品組分依據(jù)兩相間作用能力的差別達到分離的目的，分離后的各組分經(jīng)檢測器檢測，再經(jīng)過工作站軟件和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)的運算處理以圖譜的形式呈現(xiàn)，最后通過餾分收集器分通道收集。
圖1 高壓制備液相色譜裝備分離工藝流程圖
2 結(jié)果與討論
2.1 填料大小的影響
在高效液相色譜中，分離過程中的柱效、負荷能力及壓降受到填料尺寸的影響。在分析液相色譜中，研究者已廣泛研究過填料大小對分離效果的影響。但在制備液相色譜中，對填料尺寸進行優(yōu)化研究卻少有報道。Eisenbeib等對不同填料大小的制備液相色譜過程進行了研究，認為在制備液相色譜中，使用大顆粒填料并適當增加柱長，可使分離效果基本不下降。從目前的研究現(xiàn)狀來看，有關(guān)制備液相色譜的色譜填料尺寸優(yōu)化問題還沒有得到很好的解決。本文利用自行設(shè)計的高壓制備液相色譜分離裝備，通過千層塔中石杉堿甲的分離純化，對填料尺寸對分離性能的影響進行了研究。過程分離性能以石杉堿甲的分離度及柱效來表示。
為考察填料大小對制備分離效果的影響，本文采用不同大小的色譜填料，對高壓制備液相色譜過程進行了研究。圖2給出了不同粒徑下流動相流速對柱效的影響。結(jié)果表明，當其他條件相同時，柱效隨填料粒徑的增大而降低。
圖2 不同粒徑下流動相流速對柱效的影響
2.1 填料大小的影響
在高效液相色譜中，分離過程中的柱效、負荷能力及壓降受到填料尺寸的影響。在分析液相色譜中，研究者已廣泛研究過填料大小對分離效果的影響。但在制備液相色譜中，對填料尺寸進行優(yōu)化研究卻少有報道。Eisenbeib等對不同填料大小的制備液相色譜過程進行了研究，認為在制備液相色譜中，使用大顆粒填料并適當增加柱長，可使分離效果基本不下降。從目前的研究現(xiàn)狀來看，有關(guān)制備液相色譜的色譜填料尺寸優(yōu)化問題還沒有得到很好的解決。本文利用自行設(shè)計的高壓制備液相色譜分離裝備，通過千層塔中石杉堿甲的分離純化，對填料尺寸對分離性能的影響進行了研究。過程分離性能以石杉堿甲的分離度及柱效來表示。
為考察填料大小對制備分離效果的影響，本文采用不同大小的色譜填料，對高壓制備液相色譜過程進行了研究。圖2給出了不同粒徑下流動相流速對柱效的影響。結(jié)果表明，當其他條件相同時，柱效隨填料粒徑的增大而降低。
圖2 不同粒徑下流動相流速對柱效的影響
注：理論塔板高度值越大，柱效越低。
對于高壓制備液相色譜，在超載程度不是很高的情況下，分析型液相色譜的分離度公式仍可使用：
圖4 不同粒徑下柱壓與流速的關(guān)系
對于高壓制備液相色譜，在超載程度不是很高的情況下，分析型液相色譜的分離度公式仍可使用：
式中 R——分離度
a——相對保留值
R、——容量因子
L——柱長，mm
H——塔板高度，mm
由以上公式可以看出，分離度與理論塔板高度的平方根成反比，與柱效則成正比。由于柱效隨填料粒徑的增大而降低，則分離度隨填料粒徑的增大而下降。圖3給出了不同粒徑下流動相流速對石杉堿甲分離度的影響，結(jié)果表明，當其他條件相同時，石杉堿甲的分離度隨填料粒徑的增加而下降。
圖3 不同粒徑下流動相流速對石杉堿甲分離度的影響
a——相對保留值
R、——容量因子
L——柱長，mm
H——塔板高度，mm
由以上公式可以看出，分離度與理論塔板高度的平方根成反比，與柱效則成正比。由于柱效隨填料粒徑的增大而降低，則分離度隨填料粒徑的增大而下降。圖3給出了不同粒徑下流動相流速對石杉堿甲分離度的影響，結(jié)果表明，當其他條件相同時，石杉堿甲的分離度隨填料粒徑的增加而下降。
圖3 不同粒徑下流動相流速對石杉堿甲分離度的影響
從上可以看出，采用小顆粒色譜填料可以提高柱效和分離度，但是，顆粒越小，柱壓就越大。圖4是在不同粒徑下柱壓與流速的關(guān)系曲線，結(jié)果表明，粒徑減小時柱壓增大，且會受到泵能力的影響。
圖4 不同粒徑下柱壓與流速的關(guān)系
綜上，高壓制備液相色譜分離過程使用小顆粒填料，可獲得良好的分離性能，柱效高，分離效果好。但是，小顆粒填料價格較貴，并且對泵的要求會提高，從而增加成本。故在可以滿足分離要求的前提下，盡量使用大顆粒填料，以提高生產(chǎn)能力，并且價格較低，節(jié)省成本。
2.2 柱尺寸大小的影響
迄今為止，在制備液相色譜中，Godbile等研究了分離過程中柱尺寸大小對制備量的影響，Knox等發(fā)現(xiàn)大直徑柱可獲得較高的柱效，但柱尺寸對分離性能的研究還不夠完善，需要進一步深入研究，這是制備液相色譜技術(shù)能否大規(guī)模應用于工業(yè)分離過程的關(guān)鍵所在。本文利用自行設(shè)計的高壓制備液相色譜分離裝備，通過對千層塔中石杉堿甲的分離純化，研究了柱尺寸對分離性能的影響。
2.2.1 柱長的影響
為考察柱長對制備分離效果的影響，本文采用ID 50 mm×650 mm、ID 50 mm×1 000 mm這2種不同柱長的柱子，對高壓制備液相色譜分離過程進行了研究。圖5給出了不同柱長下流動相流速對柱效的影響，結(jié)果表明，當其他條件相同時，柱效隨柱長的增大而降低；圖6是不同柱長下流動相流速對分離度的影響，結(jié)果表明，當其他條件相同時，柱長增大，可顯著提高分離度。
2.2 柱尺寸大小的影響
迄今為止，在制備液相色譜中，Godbile等研究了分離過程中柱尺寸大小對制備量的影響，Knox等發(fā)現(xiàn)大直徑柱可獲得較高的柱效，但柱尺寸對分離性能的研究還不夠完善，需要進一步深入研究，這是制備液相色譜技術(shù)能否大規(guī)模應用于工業(yè)分離過程的關(guān)鍵所在。本文利用自行設(shè)計的高壓制備液相色譜分離裝備，通過對千層塔中石杉堿甲的分離純化，研究了柱尺寸對分離性能的影響。
2.2.1 柱長的影響
為考察柱長對制備分離效果的影響，本文采用ID 50 mm×650 mm、ID 50 mm×1 000 mm這2種不同柱長的柱子，對高壓制備液相色譜分離過程進行了研究。圖5給出了不同柱長下流動相流速對柱效的影響，結(jié)果表明，當其他條件相同時，柱效隨柱長的增大而降低；圖6是不同柱長下流動相流速對分離度的影響，結(jié)果表明，當其他條件相同時，柱長增大，可顯著提高分離度。
圖5不同柱長下流動相流速對柱效的影響
圖6不同柱長下流動相流速對分離度的影響
圖7是不同柱長下流動相流速對壓力降的影響，可以看出，雖然增加柱長可以顯著提高分離度，但是也使柱壓明顯提高，對泵要求也相應提高。因此，在高壓制備液相色譜分離過程中，為了提高分離效率，獲得較高的分離度，對于較難分開的化合物，可以采取增加柱長的辦法；但若在可以滿足分離要求的前提下，考慮到成本，要盡可能采用短柱來進行分離。
圖7 不同柱長下流動相流速對壓力降的影響
圖7 不同柱長下流動相流速對壓力降的影響
2.2.2 柱徑的影響
為考察柱徑對制備分離效果的影響，本文采用ID 50 mm×650 mm、ID 150 mm×650 mm這2種不同柱徑的柱子，對高壓制備液相色譜分離過程進行了研究。圖8給出了不同柱徑下流動相流速對柱效的影響，結(jié)果表明，當其他條件相同時，柱效隨柱徑的增大而降低。圖9是不同柱徑下流動相流速對分離度的影響，結(jié)果表明，當其他條件相同時，柱徑增大，分離度下降。可見增大柱徑，會使總的分離性能下降，但大柱徑可以提高柱容量，增加制備量。故在可以滿足分離要求的前提下，要盡可能的采用大柱徑柱子來進行分離。
圖8柱徑對柱效的影響
圖9柱徑對分離度的影響
為考察柱徑對制備分離效果的影響，本文采用ID 50 mm×650 mm、ID 150 mm×650 mm這2種不同柱徑的柱子，對高壓制備液相色譜分離過程進行了研究。圖8給出了不同柱徑下流動相流速對柱效的影響，結(jié)果表明，當其他條件相同時，柱效隨柱徑的增大而降低。圖9是不同柱徑下流動相流速對分離度的影響，結(jié)果表明，當其他條件相同時，柱徑增大，分離度下降。可見增大柱徑，會使總的分離性能下降，但大柱徑可以提高柱容量，增加制備量。故在可以滿足分離要求的前提下，要盡可能的采用大柱徑柱子來進行分離。
圖8柱徑對柱效的影響
圖9柱徑對分離度的影響
2.3 上樣方式的影響
在高壓制備液相色譜中，廠家為節(jié)省成本，必然要盡可能的提高分離效率并增加產(chǎn)量。為提高產(chǎn)量，可采用柱超載的上樣方式，柱超載分為2種：質(zhì)量超載（使用較小的樣品注入體積，增加樣品濃度）和體積超載（保持較低的樣品濃度，增加樣品的注入體積）。高壓制備液相色譜中，在滿足分離要求的前提下，盡可能采用質(zhì)量超載的方式進樣，可以顯著提高進樣量。當一次需要處理的上樣量太大，導致濃度過高或分離效果達不到要求時，宜采用體積超載的方式進樣。
3 結(jié)語
利用高壓制備液相色譜裝備對千層塔中的石杉堿甲進行分離提純，考察了填料大小、柱尺寸大小與上樣方式對柱效和分離度的影響。結(jié)果表明：在制備分離過程中，小顆粒填料、長柱、小直徑柱可提高分離效率；在可滿足分離要求的前提下，大顆粒填料、短柱、大直徑柱可提高生產(chǎn)能力；在滿足分離要求的前提下，采用柱超載操作方式，可提高制備量。
在高壓制備液相色譜中，廠家為節(jié)省成本，必然要盡可能的提高分離效率并增加產(chǎn)量。為提高產(chǎn)量，可采用柱超載的上樣方式，柱超載分為2種：質(zhì)量超載（使用較小的樣品注入體積，增加樣品濃度）和體積超載（保持較低的樣品濃度，增加樣品的注入體積）。高壓制備液相色譜中，在滿足分離要求的前提下，盡可能采用質(zhì)量超載的方式進樣，可以顯著提高進樣量。當一次需要處理的上樣量太大，導致濃度過高或分離效果達不到要求時，宜采用體積超載的方式進樣。
3 結(jié)語
利用高壓制備液相色譜裝備對千層塔中的石杉堿甲進行分離提純，考察了填料大小、柱尺寸大小與上樣方式對柱效和分離度的影響。結(jié)果表明：在制備分離過程中，小顆粒填料、長柱、小直徑柱可提高分離效率；在可滿足分離要求的前提下，大顆粒填料、短柱、大直徑柱可提高生產(chǎn)能力；在滿足分離要求的前提下，采用柱超載操作方式，可提高制備量。
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